兔 基质金属蛋白酶抑制因子-1（rabbit TIMP-1）ELISA

来自Transhold

                                      兔TIMP-1 ELISA

用途： 本试剂盒用于定量测定兔血清、肺泡灌洗液中的TIMP-1浓度。

原理：

本试剂盒采用双抗夹心ELISA法。抗兔TIMP-1单抗包被于酶标板上，兔标本中的TIMP-1会与单抗结合。加入生物素化的抗兔TIMP-1（二抗），它将与结合在单抗上的兔TIMP-1结合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 将与二抗的生物素结合，多余的物质会被洗掉。加入TMB显色。兔TIMP-1的浓度与OD(450nm)成正比。

试剂盒组成：

酶标板(Coated Wells)	96wells	Anti-rabbit TIMP-1 Biotin	2vial
浓缩洗涤液(40X)(Washing Concentrate)	25ml	标准品(Standards)	2vial
显色液(TMB Substrate)	12ml	标准品稀释液(Standards Diluent)	15ml
终止液(Stop Solution)	10ml	浓缩酶联物（HRP）	2vial
酶联物稀释液（HRP Diluent)	15ml	生物素稀释液（Biotin anti TIMP-1 Diluent）	15ml

需要但未提供的材料

1. 可在450nm处进行读数的酶标仪；

2. 能精确吸取10-200µL的移液器；

3. 可调多道（8）移液器（50－200µL）；

4. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽；

5. 洗瓶或洗板机；

6. 蒸馏水或去离子水；

7. 1升的圆柱形量筒；

8. 血清移液器：1和（10或25 mL）；

9. 移液器枪头；

10. 纸巾；

11. 计时器，用以监控温育步骤；

12. 处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）；

注意事项:

1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入HRP或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

保存： 贮藏于2-8°C。

样品： 在此检测中，可使用血清、肺泡灌洗液样品。

准备工作：

1. 浓缩洗涤液(40X)用双蒸水稀释成1X（至1000ml）。

2. 标准品用1ml标准品稀释液复溶。得到20ng/ml的高浓度标准品。高浓度标准品可保存于-20°C。

3. 将20ng/ml的高浓度标准品稀释成一组标准品，如：25，12.5，6.25，3.125，1.5625，0.78，0.39，0ng/ml。

4. 配制1x HRP：一支 HRP加入6 ml 酶联物稀释液，混匀。1x HRP最好在临用前15分钟配制。

5. 配制1x Biotin：一支Biotin anti TIMP-1加入6 ml Biotin稀释液，混匀。1x Biotin最好在临用前15分钟配制。

操作步骤：

试剂盒应平衡至室温（20-25°C ）再试验。 取出所需反应板。

临用前15分钟配制工作液

1. 加入100ul标准品(Standards)、100ul标本于相应反应板孔中。

2. 轻轻混匀30秒，封住板孔，37°C温育 90分钟。

3. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350ul洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次。

4. 每孔加入100ul 1x Biotin。轻轻混匀30秒，封住板孔，37°C温育 60分钟。

5. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350ul洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次。

6. 每孔加入100ul 1x HRP。轻轻混匀30秒，封住板孔，37°C温育 30分钟。

7. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350ul洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次。

8. 每孔加入100ul TMB显色液， 轻轻混匀10秒，37°C暗处温育15±10分钟。

9. 每孔加入100ul终止液（Stop Solution）。轻轻混匀30秒；30分钟内在450nm处读OD值。

以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

举例：

注意事项：

1.作标准曲线时，要扣除标准品稀释液造成的本底；如果标本用标准品稀释液稀释，也要扣除标准品稀释液造成的本底，如果标本未用标准品稀释液稀释，标本不需扣除标准品稀释液造成的本底。

2.生物素(Biotin anti rabbit TIMP-1) 和浓缩酶联物(HRP)用前应离心，使液体位于管底。