兔 白介素6（rabbit IL-6）ELISA
来自Transhold
兔IL-6 ELISA
用途：
1980年发现成纤维细胞经Poly I－C刺激后能产生一种抑制病毒复制的细胞因子，称为β2 干扰素(IFN－β2)。以后的研究结果未能证实这种因子的直接抗病毒作用，但具有其它多方面的生物学功能，根据实验系统和功能的不同，被命名为杂交瘤／浆细胞瘤生长因子(hybridoma／plasmacytoma growth factor，HPGF)，B细胞分化因子(B cell differentiation factor，BCDF)，B细胞刺激因子－2(B cell stimulatory factor 2，BSF－2)，26kDa，溶细胞性T细胞分化因子(cytolytic T cell differentiation factor，CDF)和肝细胞刺激因子(hepatocyte stimulating factor，HSF)等。1986年统一命名白细胞介素6(interleukin 6， IL－6)。
1．IL－6的产生 淋巴样和某些非淋巴样细胞均可产生IL－6。
(1)T细胞：T细胞产生IL－6依赖于巨噬细胞或PMA。抗原提呈细胞刺激相应的T细胞克隆，以及HTLV－I感染的T细胞系等均可分泌IL－6。
(2)B细胞：如SAC刺激而活化的B细胞。
(3)单核细胞：LPS刺激单核细胞产生IL－6，某些单核细胞系如P388D1也可分泌IL－6。
(4)成纤维细胞：可自发产生IL－6，其它因子或刺激物如IL－1、TNF、PDGF、IFN－β、 PolyI－C、A23187、PMA等可促进IL－6的产生。
(5)肾小球系膜细胞、角朊细胞、内皮细胞等在一定培养条件下均可产生IL－6。此外， 肿瘤细胞或细胞系如MG63成骨肉瘤、T24膀胱癌、A549肺癌、7860肾癌、SK－MG－4神经胶质母细胞瘤、U373星状细胞瘤、心脏粘液瘤细胞和骨髓瘤细胞等也能分泌IL－6。 IL－1、TNF、IFN－β、PDGF、LPS、PolyI－C、A23187和PMA等对IL－6的产生具有正调节作用。
2． IL－6的分子结构和基因 1985年Kishimoto等从人T细胞中首先获得IL－6 cDNA克隆成功，人IL－6基因与小鼠有65％同源性。人IL－6基因位于第7号染色体，长约5kb， 有5个外显子和4个内含子。
在IL－6基因功能调节区基因中存在着几种转录控制元件(transcriptional control element)，如糖皮质激素反应元件(ghcocorticoid responsive elements，GRE)、AP－1 结合位点、C－fos血清反应元件同源物(C－losserumresponsiveelementhomology，C－fos SRE homology)，cAMP反应元件(cycli AMP responsive element，CRE)和NF－KB结合位点。 IL－1、TNF等细胞因子可使IL－6启动子很快发生一过性的活化。 IL－1反应的元件在IL－6启动基中－180／－123;IL－6核因子(NF－IL－6)识别一段特殊的14bp，ACATTGCACAATCT。多反应元件(multi－response element，MRE)位于c－fos SRE同源区内，这个区域对IL－1、TNF、forskolin和PMA诱导IL－6产生有关；与IL－1、TNF刺激IL－6产生有关的NF－KB位于TATA盒的上游。
人IL－6分子由212个氨基酸残基组成，包括28个氨基酸残基的信号序列，成熟IL－6为184氨基酸残基，分子量26kDa。IL－6分子由4个α螺旋和C端(175～181位氨基酸)受体结合点所组成，其中179位精氨酸残基对于与受体的结合非常重要。 分子中糖基对生物学活性功能并非必需，N端23个氨基酸残基虽不直接与IL－6生物学活性有关， 但对整个 IL－6分子组成起稳定作用。人IL－6氨基酸序列与小鼠IL－6有42％同源性，人的IL-6对小鼠某些细胞有刺激作用。IL－6与G－CSF和IFN－β有较高同源性，对骨髓造血细胞和髓样白血病细胞的某些作用也有相似之处。
3． IL－6的受体目前已知，IL－6R至少由称之为IL-6结合受体蛋白(IL－6 binding receptor protein)和称为信号转导蛋白(signal－transducing protein)的gpl30所组成，习惯上前者称之IL－6R。
(1)IL－6R(CDl26)：人IL－6R由468个氨基酸组成，切除N端19个氨基酸残基后的成熟分子有449氨基酸，胞膜外区、穿膜区和胞浆区分别为339、28和82个氨基酸，分子量为80kDa，6个N糖基化位点。胞膜外区由一个Ig样区(C2，约100氨基酸)、2个Ⅲ型纤维结合蛋白结构(各含100氨基酸)及1个细胞因子受体的同源区所组成，后者含4个保守的Cys和一个WSXWS结构。单独IL－6R与IL－6结合为低亲和力。IL－6R分布于淋巴样细胞和非淋巴样细胞，如活化B细胞、EBV转化B细胞、急性淋巴母细胞白血病细胞、骨髓瘤细胞、静止T细胞、肝细胞、单核细胞、急性髓样白血病(AML)细胞、嗜铬细胞瘤细胞等。
(2)gpl30(CDw130)：分子量为130kDa的糖蛋白，共有14个潜在N－糖基化位点，胞膜 外区、穿膜区和胞浆区分别有597、22和277个氨基酸。胞膜外区有1个IgC2区，6个III型纤维结合蛋白的结构，其中第二个和第三个结构区之间有4个保守的Cys和WSXWS结构的区域，形成1个细胞因子受体家族结构特征的结构域。gpl30不能直接与配基IL－6结合，在生理情况下， IL－6与IL－6受体结合后使IL－6R的构象发生变化并迅速与两个gpl30分子结合，形成高亲和力的结合位点，并通过gpl30亚单位传递信号。人和小鼠gpl30在氨基酸水平上有77％的同源性。转染gpl30cDNA小鼠pro－B细胞在IL－6／sIL－6R复合物刺激下可传递增殖信号。小鼠体内注射IL－6可增加gpl30mRNA的表达。目前已证实，gpl30除组成IL－6高亲和力受体外，也是白血病抑制因子(LIF)、抑瘤素M(0SM)、睫状神经营养因子(CNTF)和IL－11等受体所共用的亚单位。
(3)信号转导：gpl30与IL－6／IL-6R复合物结合后， 刺激gpl30胞内部分发生酪氨酸磷酸 化，目前关于参与此过程的酪氨酸蛋白激酶的作用还不清楚。酪氨酸激酶被激活后继而引起丝氨酸／苏氨酸激酶如丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK) 的激活，使NF－IL-6中丝氨酸和苏氨酸磷酸化而被激活，从而促进相应基因的活化。
(4)sIL－6R：存在于正常人尿、骨髓瘤细胞系U266培养上清，PHA活化人PBMC以及 HTLV－I阳性细胞也能分泌sIL－6R，分子量为50kDa。用反转录PCR从正常人细胞和骨髓瘤细胞中均分离出编码sIL－6R mRNA，序列分析表明与膜结合受体相应区域序列一致。sIL－6也可从膜结合的IL－6R(mIL－6)脱落而来。sIL－6R与IL－12 p40亚基具有高度同源性，而IL－6与IL－12的p35亚基序列高度同源。因此可以推测类似于IL-6／sIL-6R复合物的IL－12分子可能也通过类似于gpl30分子作用于细胞。与其它可溶性细胞因子受体不同，sIL－6R结合IL－6后可与细胞膜表面gpl30结合，增强IL－6的刺激活性。而可溶性gpl30(sgpl30)可抑制sIL－6R／IL－6复合物的活性。sIL－6R水平的升高与某些自身免疫性疾病有关。
4． IL-6的生物学活性
(1)刺激细胞生长：IL－6可促进多种细胞的增殖，如B淋巴细胞杂交瘤、浆细胞瘤、EBV 转化的B细胞、T细胞、 PMA和IL－4刺激的胸腺细胞、造血干细胞、角朊细胞和肾小球系膜细胞。
(2)促进细胞分化：如B细胞分化和Ig的分泌，CTL分化，协同IL-2增强CTL中穿孔素基因的表达，并增加T细胞IL－2产生和IL－2R表达，诱导巨噬细胞、神经细胞和NK细胞分化。协同IL－3促进干细胞分化和巨核细胞的成熟。明显促进小鼠骨髓移植后免疫功能的重建。
(3)加速肝细胞急性期蛋白(acute phase protein)的合成。
(4)抑制M1髓样白血病细胞系的生长，促进其成熟和分化；抑制黑素瘤、乳腺癌细胞生长。
本试剂盒用于定量检测兔血清、细胞培养上清液和组织匀浆中的IL-6的浓度。
原理：
本试剂盒采用双抗夹心ELISA法。抗兔IL-6单抗包被于酶标板上，兔标本中的IL-6会与单抗结合。加入生物素化的抗兔IL-6（二抗），它将与结合在单抗上的兔IL-6结合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 将与二抗的生物素结合，多余的物质会被洗掉。加入TMB显色。兔IL-6的浓度与OD(450nm)成正比。
试剂盒组成：
| 酶标板(Coated Wells) | 48wells | Anti-rabbit IL-6 Biotin | 1 vial |
| 浓缩洗涤液(40X)(Washing Concentrate) | 12.5ml | 标准品(Standards) | 1 vial |
| 显色液(TMB Substrate) | 6ml | 标准品稀释液(Standard Diluent) | 7ml |
| 终止液(Stop Solution) | 6ml | 浓缩酶联物（HRP） | 1vial |
| 酶联物稀释液(HRP Diluent) | 7ml | 生物素稀释液(Biotin Diluent) | 7ml |
需要但未提供的材料
1. 可在450nm处进行读数的酶标仪；
2. 能精确吸取10-200µL的移液器；
3. 可调多道（8）移液器（50－200µL）；
4. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽；
5. 洗瓶或洗板机；
6. 蒸馏水或去离子水；
7. 1升的圆柱形量筒；
8. 血清移液器：1和（10或25 mL）；
9. 移液器枪头；
10. 纸巾；
11. 计时器，用以监控温育步骤；
12. 处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）；
注意事项:
1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入HRP或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。
4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6. 在储存和温育时避免强光直接照射。
7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
9. 不能使用过期产品。
10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
保存： 贮藏于2-8°C。
样品： 在此检测中，可使用血清、细胞培养上清液和组织匀浆样品。
准备工作：
1. 浓缩洗涤液(40X)用双蒸水稀释成1X（至500ml）。
2. 标准品用1ml标准品稀释液复溶。得到2000pg/ml的高浓度标准品。高浓度标准品可保存于-20°C。
3. 将2000pg/ml的高浓度标准品稀释成一组标准品，如： 1000, 500, 250, 125, 62.5,31.25,15.6, 0pg/ml。
4. 配制1x HRP：一支 HRP加入6 ml 酶联物稀释液，混匀。1x HRP最好在临用前15分钟配制。
5. 配制1x Biotin：一支Biotin anti rabbit IL-6加入6 ml Biotin稀释液，混匀。1x Biotin最好在临用前15分钟配制。
操作步骤：
试剂盒应平衡至室温（20-25°C ）再试验。取出所需反应板。
临用前15分钟配制工作液
1. 加入100ul标准品(Standards)、100ul血清于相应反应板孔中。
2. 轻轻混匀30秒，封住板孔，37°C温育90分钟。
3. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350ul洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次。
4. 每孔加入100ul 1x Biotin。轻轻混匀30秒，封住板孔，37°C温育 60分钟
5. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350ul洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次。
6. 每孔加入100ul 1x HRP。轻轻混匀30秒，封住板孔，37°C温育 30分钟
7. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350ul洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次。
8. 每孔加入100ul TMB显色液， 轻轻混匀10秒，37°C暗处温育15±10分钟。
9. 每孔加入100ul终止液（Stop Solution)。轻轻混匀30秒；30分钟内在450nm处读OD值。
以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
举例：
注意事项：
1. 作标准曲线时，要扣除标准品稀释液造成的本底；如果标本用标准品稀释液稀释，也要扣除标准品稀释液造成的本底，如果标本未用标准品稀释液稀释，标本不需扣除标准品稀释液造成的本底。
2. 生物素(Biotin anti rabbit IL-6) 和浓缩酶联物(HRP)用前应离心，使液体位于管底
