影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法

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ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在科研上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。

下面将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下：

操作步骤：

目录 1 选择试剂： 2 标本收集与保存： 3 试剂使用中的准备工作及注意事项： 4 加 样： 5 温 育： 6 洗 板： 7 显 色： 8 终 止： 9 读 板： 10 全过程： 11 ELISA实验的结果判断和数据分析

选择试剂：

选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。

参考准备ELISA实验的正确步骤#ELISA实验的事前准备工作一

标本收集与保存：

1. 避免使用肉眼可见的溶血标本、高脂标本和混浊标本；
2. 2-8℃下，标本可放置24-48小时，长期保存需放置-20℃下。
3. 请避免反复冻融。

具体请参照：

ELISA实验标本的采集与处理：

ELISA实验标本的保存：

试剂使用中的准备工作及注意事项：

试剂盒中会有提示，一般需要准备的有：

• 洗涤液；用前配制；有的试剂盒会标明，配好的4度下一般可以放一个月；如果没有标明，尽量用新鲜的，不要多配制。
• 显色液（有A液和B液的），用前15分钟配制；
• 标准品：有的试剂盒中标准品是已经配制好的，4度保存；有的是要现配制的；按照说明书操作；
• 浓缩生物素结合的二抗和HRP：如果需要配制，试剂盒没注明配好可以保存多久的话，尽量现配现用（用前15分钟配制）；

原则是：

• 试剂盒上没有指出配制物的储藏方式的话，应该现配现用；不要怕麻烦；
• 还有，小瓶的管子开盖前要离心，以免盖子上粘连以后总量不够。

加 样：

室温温育的试剂，特别是温育时间比较短的实验操作的试剂，加样对数据的影响比较大。特别要注意加样问题。

• 不好的操作原因：

1. 不会正确使用加样器；
2. 血清或血浆标本分离不好即进行加样；
3. 手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；
4. 加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外；

• 解决办法：

1. 熟悉加样器的使用，在进行实验之前用水来练习加样的快速和准确；
2. 试验前标本需缓慢升温至室温，若标本为血清，冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测；
3. 加样时应将所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出；
4. 加样后及时放入孵箱；
5. 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干；
6. 如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂；
7. 标本较多时，请分批操作。每次加样最好在两到三分钟内完成。加标本时最好三排一加。每次加完样进行计时；

参考ELISA#加样

温 育：

• 不好的操作原因：

1. 温育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；
2. 温育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。

• 解决办法：

1. 贴封片或加盖：为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。
2. 按说明步骤严格控制操作时间。
3. 建议采用空气浴进行温育。

参考ELISA实验操作中的温育(incubation)

洗 板：

• 结果不好的可能原因

1. 采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。
2. 采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。
3. 反应板过多造成洗板等待时间长。
4. 在间接法中如本底较高。

• 在ELISA 操作中，洗涤是最主要的关键技术，操作时尤为注意：

1. 保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸或毛巾（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干（若使用易掉渣的纸，纸屑会留在板孔中，由于纸屑中含有氧化剂而造成高值阴性。）；
2. 注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释，应按要求稀释，所用的水电导率最好在1.5us/cm 之下，洗液如果结晶应待其融解后配制。
3. 保证洗板浸泡时间为40 秒左右，孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。
4. 合理安排，或多用几台洗板机。
5. 在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。

参考ELISA#洗涤

显 色：

• 结果不好的可能原因

1. 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；
2. 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。

• 解决方法：

1. 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用；
2. 加样时保持显色剂不外流，且加样量要准确，顺序不能颠倒。
3. A、B液应避免接触金属器械。

可以参考ELISA#显色和比色

终 止：

• 结果不好的可能原因：

• 加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。

• 解决方法：

• 加终止液时应避免产生气泡，及时终止显色。

读 板：

• 结果不好的可能原因：

• 读板时板底底部不透明、带水滴、有划痕及不规则的表面。

• 应保证酶标板清洁。

• 此外酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30 分钟，测读结果更稳定。

全过程：

• 整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸;
• 实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。

严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证ELISA必要条件。在实际操作中必须严格遵照规定操作，以严谨的作风检测每一份标本，才能保证试验效果。

ELISA实验的结果判断和数据分析

请参考试剂盒的说明书。

• 示例：
• 某定量试剂盒：

原理和综述部分可以参考ELISA#ELISA实验的结果判断