狗 肿瘤坏死因子a（TNF-a）ELISA

来自Transhold

                                     狗TNF-a ELISA

用途：

1975年Carswell等发现接种BCG的小鼠注射LPS后，血清中含有一种能杀伤某些肿瘤细胞或使体内肿瘤组织发生出血坏死的因子，称为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)。1985年Shalaby把巨噬细胞产生的TNF命名为TNF-α，把T淋巴细胞产生的淋巴毒素(lymphotoxin,LT)命名为TNF-β。TNF-α又称恶质素。

 1. TNF的产生 

(1)TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，LPS是较强的刺激剂。IFN-γ、M-CSF、GM-CSF对单核细胞/巨噬细胞产生TNF-α有刺激作用，而PGE则有抑制作用。前单核细胞系U937、前髓细胞系HL-60在PMA刺激下可产生较高水平的TNF-α。T淋巴细胞、T细胞杂交瘤、T淋巴样细胞系以及NK细胞等在PMA刺激下也可分泌TNF-α。SAC、PMA、 抗IgM可刺激正常B细胞产生TNF-α。此外，中性粒细胞、LAK、星状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞亦可产生TNF-α。

 (2)TNF-β是一种淋巴因子，抗原和丝裂原均可刺激T淋巴细胞分泌TNF-β。PMA刺激RPMI1788B淋巴母细胞可分泌高水平TNF-β。 

2. TNF的分子结构和基因

 (1)人的TNF-α基因长约2.76kb，小鼠为2.78kb，结构非常相似， 均由4个外显子和3个内含子组成，与MHC基因群密切连锁，分别定位于第6对和第17对染色体上。1984年从HL-60、U937等细胞中克隆成功rHu TNF-α cDNA，并在大肠杆菌中获得高表达。 人TNF-α前体由233个氨基酸残基组成，含76个氨基酸残基的信号肽， 切除信号肽后成熟型TNF-α为157氨基酸残基，非糖基化，第69位和101位两个半胱氨酸形成分子内二硫键。rHu TNF-α分子量为17kDa。小鼠TNF-α前体为235氨基酸残基，信号肽79氨基酸残基，成熟的小鼠TNF-α(rMuTNF-α)分子量为17kDa，由156个氨基酸残基组成， 第69位和100位两个半胱氨酸形成分子内二硫键，有一个糖基化点，但糖基化不影响其生物学功能。rHu TNF-α与rMu TNF-α有79％氨基酸组成同源性，TNF-α的生物学作用似无明显的种属特异性。最近有人报道通过基因工程技术表达了N端少2个氨基酸(Val、Arg)的155氨基酸人TNF-α， 具有更好的生物学活性和抗肿瘤效应。此外，还有用基因工程方法，将TNF-α分子氨基端7个氨基酸残基缺失，再将8Pro、9Ser和10Asp改为8Arg、9Lys和10Arg，或者再同时将157Leu改为157Phe,改构后的TNF-α比天比天然TNF体外杀伤L929细胞的活性增加1000倍左右，在体内肿瘤出血坏死效应也明显增加。TNF-α和β发挥生物学效应的天然形式是同源的三聚体。

 (2)人和小鼠TNF-β基因分别定位于第6和第17号染色体。HuTNF-β分子由205 个氨基酸残基组成，含 34 氨基酸残基的信号肽，成熟型Hu TNF-β分子为171个氨基酸残基，分子量25kDa。rMu TNF-β分子由202氨基酸残基组成，包括33个氨基酸残基的信号肽，成熟分子169个氨基酸残基，与Hu TNF-β有79％的同源性。Hu TNF-β与Hu TNF-α DNA同源序列达56％，氨基酸水平上同源性为36％。

 3. TNF的受体

 (1)TNF-R的分型:TNF-R可分为两型:Ⅰ型TNF-R，55kDa, CD120a,439氨基酸残基，此型受体可能在溶细胞活性上起主要作用；Ⅱ型TNF-R,75kDa CD120b，426氨基酸残基，此型受体可能与信号传递和T细胞增殖有关。两型TNF-R均包括胞膜外区、穿膜区和胞浆区三个部分, 胞膜外区有28％的同源，但在胞浆区无同源性，可能与介导不同的信号转导途径有关。TNF-R属于神经生长因子受体(NGFR)超家族。 TNF-α和TNF-β的受体可能是同一的。TNF-R存在于多种正常及肿瘤细胞表面， 一般每个细胞受体数目在103～104，如ME-180肿瘤细胞系TNF-αR约2000/个细胞，Kd为2×10-10M。不同细胞表面TNF-αR的数目和亲和力似乎与细胞对TNF-α的敏感性并不平行。 TNF-α与相应受体结合后信号传递的机理尚不清楚，可能与活化蛋白激酶C(PKC)，催化受体蛋白磷酸化有关。

 (2)可溶性TNFR: TNF结合蛋白(TNF-BP)是TNFR的可溶性形式，有sTNF RⅠ(TNF-BPI)和sTNFRⅡ(TNF-BPⅡ)两种。一般认为sTNFR具有局限TNF活性，或稳定TNF的作用，在细胞因子网络中有重要的调节作用。Seckiner 1988年发现发热患者尿中有TNF抑制物,分子量为33kDa。Olsson 1989年在慢性肾功不全患者血和尿中也发现有TNF-BP。TNF-BP可与TNF特异结合，抑制TNF活性，如抑制其细胞毒活性和诱导IL-1产生，可促进皮下接种Meth A肉毒的生长，可能为肿瘤逃逸宿主抗肿瘤的机制之一。正常人血清中TNF-PB为1～2ng/ml，也可见于正常妊娠尿中。炎症、内毒素血症、脑膜炎双球菌感染、SLE、HIV感染、肾功不全时以及肿瘤时可升高。可溶性TNFR可有效地减轻佐剂性关节炎的病理改变以及败血症休克。

 4. TNF的生物学活性 TNF-α与TNF-β的生物学作用极为相似，这可能与分子结构的相似性和受体的同一性有关。但在某些生物学作用方面也有不同之处。

(1)杀伤或抑制肿瘤细胞:TNF在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞(cytolytic action),或抑制增殖作用(cytostatic action)。肿瘤细胞株对TNF-α敏感性有很大的差异， TNF-α对极少数肿瘤细胞甚至有刺激作用。用放线菌素D、丝裂霉素C、放线菌酮等处理肿瘤细胞(如小鼠成纤维细胞株L929)可明显增强TNF-α杀伤肿瘤细胞活性。体内肿瘤对TNF-α的反应也有很大的差异，与其体外细胞株对TNF-α的敏感性并不平行。同一细胞系可能有敏感株和抵抗株如L929-S和L929-R。此外，靶细胞内源性TNF的表达可能会使细胞抵抗外源性TNF的细胞毒作用，因此，通过诱导或抑制内源性TNF的表达可改变细胞对外源性TNF的敏感性。巨噬细胞膜结合型TNF可能参与对靶细胞的杀伤作用。

 TNF杀伤肿瘤的机理还不十分清楚，与补体或穿孔素(perforin)杀伤细胞相比，TNF杀伤细胞没有穿孔现象,而且杀伤过程相对比较缓慢。TNF杀伤肿瘤组织细胞可能与以下机理有关。

　　①直接杀伤或抑制作用:TNF与相应受体结合后向细胞内移，被靶细胞溶酶体摄取导致溶酶体稳定性降低，各种酶外泄，引起细胞溶解。也有认为TNF激活磷脂酶A2， 释放超氧化物而引起DNA断裂，磷脂酶A2抑制剂可降低TNF的抗病效应。TNF可或改变靶细胞糖代谢,使细胞内pH降低，导致细胞死亡。

 ②通过TNF对机体免疫功能的调节作用，促进T细胞及其它杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤。

 　　③TNF作用于血管内皮细胞，损伤内皮细胞或导致血管功能紊乱， 使血管损伤和血栓形成，造成肿瘤组织的局部血流阻断而发生出血、缺氧坏死。

 　　(2)提高中性粒细胞的吞噬能力，增加过氧化物阴离子产生，增强ADCC功能， 刺激细胞脱颗粒和分泌髓过氧化物酶。TNF预先与内皮细胞培养可使其增加MHCⅠ类抗原、ICAM-1的表达，IL-1、GM-CSF和IL-8的分泌，并促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上，从而刺激机体局部炎症反应，TNF-α的这种诱导作用要比TNF-β为强。TNF刺激单核细胞和巨噬细胞分泌IL-1，并调节MHCⅡ类抗原的表达。

 　　(3)抗感染:如抑制疟原虫生长，抑制病毒复制(如腺病毒Ⅱ型、疱疹病毒Ⅱ型)， 抑制病毒蛋白合成、病毒颗粒的产生和感染性，并可杀伤病毒感染细胞。 TNF抗病毒机理不十分清楚。

 　　(4)TNF是一种内源性热原质，引起发热，并诱导肝细胞急性期蛋白的合成。 TNF引起发热可能是通过直接刺激下丘脑体温调节中枢和刺激巨噬细胞释放IL-1而引起，还可通过IL-1、TNF-α刺激其它细胞产生IL-6。

 　　(5)促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化，如促进髓样白血病细胞ML-1、 单核细胞白血病细胞U937、早幼粒白血病细胞HL60的分化，机理不清楚。TGF-β可抑制TNF-α多种生物学活性，但不抑制TNF-α对髓样白血病细胞分化的诱导作用，甚至还有协同效应。

 　　(6)促进细胞增殖和分化: TNF促进T细胞MHCⅠ类抗原表达，增强IL-2依赖的胸腺细胞、T细胞增殖能力，促进IL-2、CSF和IFN细胞的增殖和Ig分泌。TNF-α对某些肿瘤细胞具有生长因子样作用，并协同EGF、PDGF和胰岛素的促增殖作用，促进EGF受体表达。TNF也可促进c-myc和c-fos等与细胞增殖密切相关原癌基因的表达，引起细胞周期由Go期向G1期转变。最近报道TNF-β(LT)是EB病毒转化淋巴母细胞的自分泌生长因子，抗LT抗体、sTNF R以及TNF-α能抑制EB病毒转化淋巴细胞的增殖。

 本试剂盒用于定量检测狗血清中的TNF-a的浓度。

原理：

本试剂盒采用双抗夹心ELISA法。抗狗TNF-a单抗包被于酶标板上，狗标本中的TNF-a会与单抗结合。加入生物素化的抗狗TNF-a（二抗），它将与结合在单抗上的狗TNF-a结合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 将与二抗的生物素结合，多余的物质会被洗掉。加入TMB显色。狗TNF-a的浓度与OD(450nm)成正比。

试剂盒组成：

酶标板(Coated Wells)	96wells	Anti-dog TNF-a Biotin	2 vials
浓缩洗涤液(100X)(Washing Concentrate)	10ml	标准品(Standards)	2 vials
显色液(TMB Substrate)	12ml	标准品稀释液(Standard Diluent)	15ml
终止液(Stop Solution)	12ml	浓缩酶联物（HRP）	2 vials
酶联物稀释液(HRP Diluent)	15ml	生物素稀释液(Biotin Diluent)	15ml

需要但未提供的材料

1. 可在450nm处进行读数的酶标仪；

2. 能精确吸取10-200µL的移液器；

3. 可调多道（8）移液器（50－200µL）；

4. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽；

5. 洗瓶或洗板机；

6. 蒸馏水或去离子水；

7. 1升的圆柱形量筒；

8. 血清移液器：1和（10或25 mL）；

9. 移液器枪头；

10. 纸巾；

11. 计时器，用以监控温育步骤；

12. 处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）；

注意事项:

1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入HRP或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

保存：

贮藏于2-8°C。

样品：

在此检测中，可使用血清样品。

准备工作：

1. 浓缩洗涤液(100X)用双蒸水稀释成1X（至500ml）。

2. 标准品用1ml标准品稀释液复溶。得到2000pg/ml的高浓度标准品。高浓度标准品可保存于-20°C。

3. 将2000pg/ml的高浓度标准品稀释成一组标准品，如： 1000, 500, 250, 125, 62.5, 0pg/ml。

4. 配制1x HRP：一支 HRP加入6 ml 酶联物稀释液，混匀。1x HRP最好在临用前15分钟配制。

5. 配制1x Biotin：一支Biotin anti dog TNF-a加入6 ml Biotin稀释液，混匀。1x Biotin最好在临用前15分钟配制。

操作步骤：

试剂盒应平衡至室温（20-25°C ）再试验。取出所需反应板。

临用前15分钟配制工作液

1. 加入100ul标准品(Standards)、100ul血清于相应反应板孔中。

2. 轻轻混匀30秒，封住板孔，37°C温育 60分钟。

3. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350ul洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次。

4. 每孔加入100ul 1x Biotin。轻轻混匀30秒，封住板孔，37°C温育 60分钟

5. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350ul洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次。

6. 每孔加入100ul 1x HRP。轻轻混匀30秒，封住板孔，37°C温育 30分钟

7. 洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板（每孔内加入350ul洗涤液），并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干）；反复洗涤5次。

8. 每孔加入100ul TMB显色液， 轻轻混匀10秒，37°C暗处温育15±10分钟。

9. 每孔加入100ul终止液（Stop Solution)。轻轻混匀30秒；30分钟内在450nm处读OD值。

以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

举例：

注意事项：

1. 作标准曲线时，要扣除标准品稀释液造成的本底；如果标本用标准品稀释液稀释，也要扣除标准品稀释液造成的本底，如果标本未用标准品稀释液稀释，标本不需扣除标准品稀释液造成的本底。

2. 生物素(Biotin anti dog TNF-a) 和浓缩酶联物(HRP)用前应离心，使液体位于管底。