荧光PCR
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荧光定量PCR技术 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
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荧光PCR,定量（quantification）PCR, real-time PCR,RT-PCR ,RT-real time PCR,荧光定量PCR几个概念的区分
荧光PCR，是指使用荧光标记的方法对PCR的过程进行监测，从而进行定性和定量分析的一种技术。由于通过全自动仪器进行过程的全程监控，所以，荧光PCR 有时更严格的称为real time PCR，这两个概念在目前可以基本等同。
从以前的电泳法PCR 跨越到荧光PCR，很方便的实现了对病原体和基因的定量检测，所以，荧光和定量两个词又是紧密联系的；有些时候，定量PCR可以指荧光PCR；但二者其实并不等同。
real-time PCR是可以定性，也可以定量（quantification）。
RT-PCR 是针对RNA的，需要先把RNA逆转录成为CDNA，然后进行PCR或者real time PCR。可以用两步法进行拟转录后再进行PCR，这就是RT-PCR；如果第二步的PCR采用荧光PCR来监测扩增结果，这就是RT-real time PCR，或者叫RT-荧光PCR。事实上，RT-real time PCR既是RT-PCR的一种，也是荧光PCR的一种应用。当应用某种特殊的酶，同时含有逆转录和扩增的功能，可以实现一步法进行RT-荧光PCR。
荧光PCR的定量原理(数学原理）
根据定量原理，荧光定量PCR的分类
荧光定量PCR的绝对定量
绝对定量的单位是copy/ml，ng/ml，pg/ml，IU/ml。
方法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其标准品的量是预先可知的。质粒DNA和体外转入的RNA常作为绝对定量标准品的制备之用。标准品的量可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来转换成其拷贝数来确定。
荧光定量PCR的相对定量
相对定量是指相对值，或者倍数。
此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n倍。在实验中为了标准化加入反应体系的RNA或DNA的量，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些管家基因（如beta-actin,3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH等）。
比较CT法与标准曲线法的相对定量的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到CT值来反应起始模板的量，一个循环（CT=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。
根据化学原理，荧光定量PCR的分类
实时荧光PCR定量反应包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是不利用杂交原理，而利用其他的一些理化特征指示扩增产物的增加。荧光探针法由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但荧光染料法则简便易行。
FRET探针、Taqman、分子信标、LUX 引物、荧光染料法进行荧光定量PCR的性质特点比较
荧光PCR的优点
荧光PCR区别于其他PCR方法主要有以下优点：
- 全封闭反应，无需PCR后处理
- 特异性强，灵敏度高
- 采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确
- 定量范围宽，可达到10个数量级
- 仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断
- 可实现一管双检或多检
- 操作安全，缩短时间，提高效率
- 利于自动化和联网管理
荧光定量PCR常用名词解释
荧光域值（threshold）
PCR扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近。
一般情况下，PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。可以自己手动设置。
Threshold Cycle (TC or CT) OR Cross Point(CP)，一般用CT
PCR增长信号与Threshold发生交汇的循环数，也是FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。
Standard Curve(标准曲线)：
CT与起始模板量的对数呈反比关系：Y=-aX+b
其中X=Log Concentration
Y=CT
PCR扩增过程中，引入一系列已知起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，利用该系列模板的CT/TC/CP值与已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而计算出未知样品的起始模板浓度。
实时定量PCR引物设计指南
荧光定量PCR探针设计
如何选择探针合成标记的荧光基团
准备作real time PCR，当设计了引物和探针以后，需要对引物和探针进行合成。如何选择探针合成标记的荧光基团：
厂家可能提供以下清单，TaqMan Probe（5’FAM，3’TAMRA），3’ or 5’ TET or HEX， 3’ or 5’ TAMRA or Rox，3’ Dabcyl， 5’ Cy5 or 5’ Cy3；上面的这些是荧光染料，如FAM发蓝光，Cy3绿光，ROX黄光，Cy5红光。
一般情况下，标准的双标记探针 ，即TaqMan Probe探针， 5’modification为 6-FAM、HEX、 TET，3’多用TAMRA。
分子信标（Molecular Beacons）， 5' modification为 6-FAM、TET、HEX、Cy5、 Cy3、 TAMRA、ROX,、Texas Red、Oregon Green等，3’ 为Dabcyl。
不同的机器所能使用的染料是不同的，应该选择与RealTime 仪器和您设计的探针相适应的染料。
荧光定量PCR 标准品的制备：
对于检测的目的基因是DNA的体系，制作标准曲线的样品是DNA。
如果用相对定量法，
对于检测的目的基因是RNA的体系，制作标准曲线的样品可以是RNA或者cDNA。
应用real time RT-PCR进行定量时，制作标准曲线的样品最好为RNA，因为如果以cDNA为标准品的话，则忽略了反转录的反应效率。而以RNA样品制作标准曲线，则是考虑了反转录和PCR两方面的反应效率，使定量更加准确。
RNA标准品可以是： 1、人工合成RNA（体外转录RNA） 2、高浓度的提取RNA。
其中后者的制作方法：(对于前者还没有研究到底是怎么回事) 选择想要定量的基因（看家基因、目的基因）的表达量较高的实验材料，进行RNA的大量制备，准备高浓度的RNA样品，然后进行梯度稀释，得到标准品，用于制作标准曲线。
荧光定量PCR常用仪器
影响常规PCR及实时定量PCR的因素
荧光定量PCR应用
基因表达的定量研究
基因分型
遗传分析及遗传疾病的基因定量研究
病原体感染定量分析
肝炎类
性病类病原体
优生优育类病原体
呼吸道疾病病原体
血液筛查
