荧光PCR的定量原理
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PCR定量的困难?
- 原始待测模板核酸的扩增;
- 任何干扰PCR指数扩增的因素如核酸扩增仪孔间温度差异、临床标本中DNA聚合酶抑制剂的存在、加样的差异、待测标本中靶核酸模板的量等都会影响扩增产物的量;
- 扩增产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增产物很难对原始模板进行准确定量。
PCR扩增的理论模式
PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：
Yn=Yn-1·(1+E) 0≤E≤1 (1)
其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。
而扩增一定的周期数后，扩增产物的总数量可以下式表示：
Yn=X·(1+E)n （2）
其中Y为PCR产物的分子数量，n为周期数，E为效率，位于0至1之间。 等式（2）仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增。
影响PCR扩增效率的因素
以下几点都可以影响PCR扩增的效率：
- 引物/靶的杂交；
- 反应试剂的相对量，尤其是DNA聚合酶/靶核酸之比；
- 样本在扩增仪中的位置的不同；
- 不同的临床样本中DNA聚合酶抑制物的存在；
- PCR扩增模板的量；
- 靶核酸链的再退火及酶过量可致E降低。
PCR 和定量问题
传统PCR 不能很好的解决定量问题，是由于前面说的孔与孔，不同体系之间，扩增效率不同导致，进入平台期的产物量基本上是相同的，并不能很好的反映初始模板量，从而进行定量。
如下图所示，用传统的终点法PCR很难解决定量问题。
定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别
- 定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期;当然定量PCR也可以进行定性检测。
- 而定性PCR测定的测定点则多为PCR扩增的平台期。
定量PCR的方法
定量PCR方法可归为四大类：
- 用外标准的定量PCR方法#外标方法；
- 动力学方法；
- 非竞争性内标法；
- 竞争性内标共扩增方法；
定量还可分为绝对定量（即测定X的分子数量）和相对定量（即测定不同样本中X的比率）;
相对定量与绝对定量相比较为容易。
用外标准的定量PCR方法
即是在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列稀释的已知标准（通常为质粒DNA），如果在该标准稀释系列发现扩增产物/模板成线性相关，则可推导出同时扩增的待测样本中PCR模板的相对量。
使用外标定量的要求
以外标准进行定量，必须在扩增的指数期进行；
扩增指数期取决于PCR模板的相对量。必须有大量的实验证明随着扩增周期的增加，测定结果没有变化。
应用荧光PCR 对反应过程进行监控，可以比较好的符合外标法的要求。所以，终点法用外标定量比较困难，但Real time PCR用外标法是很合适的。
外标法定量的数学原理：
第一步：确定PCR扩增的效率；
第二步：根据相应的公式计算原始模板数。
第一步：扩增效率的计算：
- 如果在PCR每一个扩增循环中扩增效率为常数，则可通过在PCR扩增的指数期的数个连续的或非连续的周期中取扩增样本，然后测定每份样本中的产物Yn的量来测定E值。有必要收集2份以上的样本，最好是尽可能多的样本以确证扩增效率保持恒定；换句话说，也就是PCR尚未达到扩增效率开始降低时的阶段。如果取的是连续的样本，则可从公式（1）测得E值；
如果取的样本不连续，则可使用下述将公式（2）重排后得到的更为通用的公式，用参数j（取样中间隔的周期数）替代n，Yj（在较高循环周期数取样的产物量）替代Yn，Yi-j（在较低循环周期数取样的产物量）替代X：
E＝－1＋（Yi/Yi-j）1/j (3)
第二步：根据相应的公式计算原始模板数（X）
- 一旦效率确定后，根据公式（4）可从测定的产物量和循环周期数计算得到X。公式（4）来源于公式（2）的重新排列：
X＝Yn /(1＋E)n （4）
- X的另一种计算方式:
根据公式（2）的对数形式，以所测定的Yn值的对数对函数n绘图得到X值：
logYn = logX + n×log(1+E) (5)
当n＝0时，可在图上读出X值，或通过对公式（5）的线性回归计算X值（图2）。
动力学方法的特点
我们这里说的动力学方法是特指用传统所说的动力学方法，现在用的比较少，即在扩增过程中选几个点测定PCR产物量。然后通过外标准的方法计算出原始浓度。这是以前RNA定量的一个通用方法，产物凝胶电泳以后测灰度，用凝胶电泳仪拍照计算样品浓度。其实前面提到的荧光PCR外标定量，从严格意义上讲也是动力学方法，通过测定每一循环的产物量（荧光值）来计算原始浓度；而且也引入了外标准。但这里的动力学方法是特指的。
这种方法的优点:
- 不需要外标准；
- 如果能测定PCR产物分子的绝对数量，则可得到待测样本的不同的扩增效率（Ee）。
动力学方法的关键点
- PCR产物定量的方法，测定信号应与产物的量成线性样关；
- 而且信号不应受抑制，或在有抑制时，抑制的程度应很小和准确已知，如果不考虑信号的抑制，则其将导致扩增效率的人为低估。
- 建议在所有应用定量PCR测定时，构建一个外标准曲线，其作用是对扩增效率和能可靠定量的浓度范围进行质控。
使用非竞争性内标准的定量PCR方法
非竞争性内标准定义和应用：
- 1）一般为与靶核酸无关的基因组；
- 2）既可是内源的也可是外源的；
- 3）与靶核酸无相同的引物结合位点和扩增序列。
- 对于DNA的扩增，非竞争性内标几乎所有的基因都可应用，最常用的有丙酮酸脱氢酶、前脑啡肽或β肌动蛋白的基因。
- 而对RNA的扩增，则非竞争性内标较难寻找。理想的mRNA内标应该在整个细胞周期中表达的水平变化不大，此外，其表达水平应接近于靶RNA，而且它们的扩增效率应相等，因此两者扩增线性区域是重合的。已有许多的mRNA被尝试用来作为此种内标，如HLA、β肌动蛋白、GPDH和组蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。
以非竞争性内标定量的主要优点：
- 内标的制备简单
- 复管测定可排除管间差异，并且在一定程度上，可排除样本间的差异。
以非竞争性内标定量的缺点:
- 内标准和靶核酸的逆转录的效率有可能不同，并且有可能既使针对的是相同的靶核酸逆转录效率也会有很大差异。因此，使用这种方法进行RNA的定量PCR测定极为困难。
- 在扩增过程中的指数期测定可对原始模板相对定量，但如果没有验证在一定的扩增周期内靶核酸和内标有相同的扩增效率，则不能进行绝对定量。
使用竞争性内标准的定量PCR方法
“竞争性”内标定义：人为构建的可与原始靶核酸竞争酶、核苷酸和引物分子的核酸标准，其特点是，与靶核酸具有相同的引物结合位点、但引物之间的顺序需加以修饰，使得扩增产物在检测时能够很容易地通过诸如凝胶电泳、探针杂交或高效液相层析等方法区分。对内标准的修饰方法包括对野生型基因组的点突变、部份缺失或插入外来顺序等，目前尚无通用的规则或程序来构建这种内标准。
使用竞争性内标准的定量PCR方法
- 使用竞争性内标既可进行相对定量也可进行绝对定量。
- 相对定量具有很好的精密度和重复性。而绝对定量，关键是要证明竞争性内标和野生型靶核酸的扩增效率相同。亦可将竞争性内标置于含已知量的野生型靶核酸的样本中同时扩增来评价。
- 要定量单份的临床样本，必须进行数管竞争性PCR测定，每管中靶核酸的量不变，但改变竞争性内标的量，因为只有当待测靶核酸与竞争性内标等摩尔量时才能有可靠的定量。
- 由于竞争性PCR可排除管间和样本间的差异，因此，其可作为准确的PCR定量方法，适用于绝对定量及含低拷贝数样本的定量。
定量PCR测定的临床应用及应注意的问题
应注意：定性和定量测定结果报告上的混淆。
定量测定的结果报告： 定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的确认诊断。 定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告>多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告<多少，如<103拷贝数/ml，而不能报告为0拷贝数/ml或阴性。
为什么要做定量测定？
- 用于已知病毒感染患者抗病毒治疗效果的动态观察及抗病毒药物的临床研究；
- 用于基因表达方面的研究，如特定的mRNA的定量测定。
总结
- 定量测定重在定量，即如何改善扩增指数期的线性及其范围。
- 定量测定的准确性较之测定下限要重要得多。
- 非竞争性内标和竞争性内标对于使用内标的定量测定方法极为关键。合适的非竞争性内标应为在整个细胞周期中均匀表达的基因核酸，而竞争性内标则应尽可能近似原始待测模板。
- 定量测定应在扩增的指数期进行，因此，更重要的是要使涉及整个扩增过程的每个参数都理想化，以便控制整个扩增，避开“扩增平台期” 。
- 由样本制备（核酸提取）方法所引起的定量测定的差异应仔细研究加以避免。
- 对于绝对定量，必须确定靶核酸和内标（竞争的和非竞争的）的扩增效率，内标应以相同的效率与靶核酸一起扩增。为增加测定结果在统计学上的可信性，建议重复多次测定。
